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  1 细胞生物手艺 2 主 主 要 内 容 第一节 培育细胞的细胞生物学 第二节 细胞培育 第三节 显微镜常识 第四节 细胞生物学尝试手艺 3 第一节 培育细胞的细胞生物学 4 次要内容 (一)体内、外细胞的差别 (二)体外培育细胞的分型 (三)培育细胞的发展和增殖历程 5 • 体外培育的细胞和体内细胞的比力 – 类似: 仍存在 细胞 和 细胞、 、 细胞 和 基质 的 互相干系 • 单个细胞虽能发展繁衍, 但 但 不如群体细胞才能强, , 当相邻细胞打仗,便招致活动截至 细胞互相相同生物信息 的成果 • 对 细胞外基质 仍有依存性 – 差别...

  1 细胞生物手艺 2 主 主 要 内 容 第一节 培育细胞的细胞生物学 第二节 细胞培育 第三节 显微镜常识 第四节 细胞生物学尝试手艺 3 第一节 培育细胞的细胞生物学 4 次要内容 (一)体内、外细胞的差别 (二)体外培育细胞的分型 (三)培育细胞的发展和增殖历程 5 体外培育的细胞和体内细胞的比力 类似: 仍存在 细胞 和 细胞、 、 细胞 和 基质 的 互相干系 单个细胞虽能发展繁衍, 但 但 不如群体细胞才能强, , 当相邻细胞打仗,便招致活动截至 细胞互相相同生物信息 的成果 对 细胞外基质 仍有依存性 差别: 落空 原有构造构造 和 细胞形状, , 分化削弱或不较着 6 细胞外基质 存在于构造中, 由细胞分解 并排泄至胞外的身分,散布在 细胞外表 或 细胞之间 的大份子,包罗 纤维性身分 ( 胶原卵白、弹性卵白和网织卵白)、 、 毗连卵白( 纤维粘连卵白、层粘连卵白)和 和 空间充填份子 ( 次要为糖胺聚糖) 等,其对细胞增殖和分化阐扬主要调控感化。 这些物资组成庞大的网架构造, 撑持并毗连 构造构造、 调理 构造的发作 和 细胞的心理举动。 。 9 3 .掌握细胞的分化 细胞经由过程与特定的细胞外基质身分感化而发作分化。 比方, 成肌细胞在 纤粘连卵白上增殖并连结未分化的表型 ;而在 层粘连卵白上则截至增殖, 停止分化 ,交融为肌管。 10 4 .到场细胞的迁徙 细胞外基质能够 掌握 细胞迁徙 的 速率 与标的目的 ,并为细胞迁徙供给“脚手架”。 细胞的迁徙 依靠于 细胞的粘附 与 细胞骨架的组装 。细胞粘附于必然的细胞外基质时 引诱 粘着斑 的构成,粘着斑是联络细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。 11 (一)体内、外细胞的差别 体内:神经和体液的调理、细胞间互相影响 体外:缺少静态均衡的不变情况 发作的变革 分化征象削弱 形状功用趋于单一化 必然工夫后灭亡大概转化得到不死性 12 体外培育的细胞仍具有研讨的意义 很多性状仍与体内不异 如体外培育的心肌细胞仍可博动, 细胞在培育中的表示,存在响应 基因封闭/开启惹起的征象,在培育的细胞中某些特定功用的损失,可为该基因的 表达与调控供给线 (二)体外培育细胞的分型 贴附型:大大都培育细胞贴附发展,属于贴壁依靠性细胞,判定细胞形状时不克不及按体内构造学标推断定 悬浮型:见于少数特别的细胞,白血病细胞,骨髓细胞或免疫细胞,不需求细胞间和细胞与培育外表的打仗 。 14 贴附型细胞的分类 成纤维细胞型 上皮型细胞 游走细胞型 多型细胞型 15 成纤维细胞型 梭型或不划定规矩三角形,发展时呈放射状。 除真实的成纤维细胞外,凡由 中胚层间充质 来源的构造,如心肌、光滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型形态。 凡培育中 形状与成纤维相似 时皆可称为成纤维细胞。 16 17 上皮型细胞: 扁平不划定规矩多角形,相互严密相连。发展时呈膜状挪动,细胞很少零丁动作。 来源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形状。 18 游走细胞型: 散在发展,不连成片,呈活泼游走或变形活动,标的目的不划定规矩。 此型细胞不不变,偶然难以和其他细胞相区分。 。 19 多型细胞型: 有一些细胞,如神经细胞难以肯定其纪律和不变的形状,可统归于此类。 20 (三)培育细胞的发展和增殖历程 21 培育细胞的性命周期 是指细胞在培育中连续增殖和发展的工夫。 品种、供体的年齿等。 人胚成纤维细胞可传30~50代,约150~300个增殖周期,能维待一年阁下,最初朽迈凋亡(Apoptosis)。小鼠的胚胎成纤维细胞仅可传几代 供体为成体或朽迈个别,则保存工夫较短; 肝细胞或肾细胞,保存工夫更短,仅能传几代或十几代。 当细胞发作遗传改动,如获长生性或恶性转化时,细胞的保存期才气够发作改动。 22 性命周期的三个阶段 原代培育期 传代期 阑珊期 23 原代培育: 从体内掏出构造, , 别离出细胞、接种培育 到 第一次传代。 原代培育( Primary Culture )期 原代培育细胞与体内原构造细胞在 形状构造 和 功用上类似性大 。 特性 细胞群是异质的( Heterogeneous ) 细胞克隆构成率( Cloning Efficiency )低,即细胞自力保存性差。 因为原代培育细胞和体内细胞性状类似性大,是检测药物很好的尝试工具 24 原代培营养为两种办法 间接接种构造块 由构造别离出细胞后接种 25 26 构造块接种:牛胎儿成纤维细胞 27 传代期: 原代培育细胞 一经传代后便改称做 细胞系(Cell Line)。此期的连续工夫最长。 在 培育前提较好状况下,细胞增殖兴旺,并能保持二倍体核型。 为连结二倍体细胞性子,细胞应在 原代培育期或传代后晚期 冻存。 普通状况下当传代10~50次阁下, 细胞 增殖逐步迟缓,以致完整截至,细胞进入第三期。 28 阑珊期: 增殖很慢 或 不增殖 ,最初阑珊 凋亡。 。 少数状况下,细胞能够发作 自觉转化(Spontaneous Transformation)。 转化的 标记 之一是细胞能够得到 长生性(Immortality)或 或 恶性性子(Malignancy)。 如许的细胞群体称 有限细胞系(Infinite Cell Line), 也称持续细胞系(Continuous Cell Line)。 有限细胞系的构成次要发作在 第二期末,或第三期初 阶段。细胞获不死性后,核型大多酿成异倍体(Heteroploid)。 29 细胞的一代保存期 1 .埋伏期 (Latent Phase ) 2 .指数增生期(Logarithmic growth Phase ) 3 .窒碍期 (Stagnate Phase ) 30 1 .埋伏期(Latent Phase ) 细胞接种培育后,先是 悬浮期 。此时细胞质回缩,胞体呈圆球形。 接着细胞贴附于底物外表,称 贴壁, , 各类细胞 贴附速率差别 ,这与细胞的 品种、培育基身分和 底物的理化性子 等亲密相干。 颠末延展历程酿成 极性细胞 可活动,根本无增殖。 细胞 接种密度大时埋伏期短。 当细胞相开端呈现并逐步增加时,标记细胞已进入指数增生期。 31 差别的细胞贴壁的工夫差别 如 巨噬细胞、成纤维细胞 等 粘附才能强, 能在数分钟至数非常钟内粘附到固相外表 如 神经元细胞、羊水细胞,粘附才能弱, 需求数小时以致更长的工夫才气粘附到固相外表 可 操纵 此特性(粘附:快、牢;慢、弱) 别离 、 纯化细胞 32 33 贴附历程 :3步 贴附因子粘附 细胞开端附着 细胞进一步 结实附着舒展 34 细胞贴壁影响身分 生物身分: 血清、培育液中的促附着因子 机器 、 物理等 其他身分: 活动:培育液活动可阻遏细胞附着 离心:增进附着 高温:可抑止附着 35 加快细胞贴壁的步伐 包被培育皿底面: 对 分化水平高、发展才能差 的细胞可在 培育瓶皿外表包被 有益于细胞粘拥护发展的生物活性物资 如:-- 经由过程其所带电荷先吸附培育皿底部, 培育的细胞再与其分离。 血清内 含有多种可以 增进细胞粘附 的 身分 削减接种 时细胞悬液的 量, 待细胞粘拥护贴壁以后,再弥补充足的培育液 36 培育液中离子身分及其浓度 如,培育液中的Ca 含量太低时倒霉于 细胞的粘附、贴壁和铺展 适宜的培育温度 37 细胞铺展 (舒展) (spread) 停止 性命举动 的一种 根本的发展特性 或发展举动 铺展情况 限制 细胞的 增殖 举动 铺展的历程 细胞先由圆形变成圆饼形( 放射状铺展细胞) 逐步放开舒展成为扁平的极性细,铺展的越好与发展基质的外表打仗面越大 极性细胞 就是细胞 在体外 的 特性性细胞形状 铺展情况 与 细胞的发展 有亲密干系 只要当 细胞铺展 到 适宜 的 水平DNA 分解 才开端 停止 38 2 , 指数增生期(Logarithmic growth Phase ) 是细胞 增值最兴旺 的阶段,是细胞一代中生机最好的期间 期, 是停止各类尝试最好的和最次要的阶段。 以细胞 指数( (Mitotic Index :MI )作为 断定 细胞发展兴旺与否 的主要 标记 。即每1000 个细胞中的相数。 体外培育细胞指数受细胞品种、培育液身分、pH 、培育箱温度等多种身分的影响。普通细胞的指数介于0.1% ~0.5% ,原代细胞指数低,长生细胞和肿瘤细胞指数可高达3% ~5% 。pH和 和培育液血清含质变动对细胞指数有很大影响 39 2 , 指数增生期(Logarithmic growth Phase ) 打仗抑止(Contact Inhibition) 因为 细胞增殖而的 互相打仗,进而 抑止细胞的 活动和增殖 殖,这类征象称打仗抑止(Contact Inhibition)。 恶性细胞则无打仗抑止征象,因而打仗抑止可作为区分一般与癌细胞标记之一。 打仗抑止是创面愈合过程当中一个非常风趣的征象。当周边的上皮向创面中心匍匐时, 一旦上皮细胞相互打仗,就 就截至分化和增殖。该征象就叫 打仗抑止 。因而, 创面上不会呈现过剩的皮赘。这也是一种非常奇妙和 奥秘的 的调控征象。 40 打仗抑止 (Contact inhibition ) 细胞互相打仗时,将截至增加; 细胞停止在细胞周期的G0 期; 转化的细胞却能够持续发展招致细胞堆叠聚集发展。 41 3 .窒碍期(Stagnate Phase ): 细胞 数目达 饱和密度后,细胞遂 截至增殖,进入窒碍期。此时 细胞数目不再增长,故也称平顶期(Plateau)。 窒碍期细胞虽不增殖,但仍有代谢举动,培育液中养分渐趋耗尽,代谢产品积聚、pH低落。 此时需做别离培育即传代,不然细胞会中毒,发作形状改动,重则从底物零落灭亡。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一代细胞的性能形态。在这类状况下,虽停止了传代,因细胞已受损,需求规复,最少还要再传1~2两代,经由过程换液裁减掉死细胞和使受损细微的细胞得以规复后,才气再用。 42 第二节 细胞培育 43 主 主 要 内 容 (一)细胞培育所需前提 (二)细胞培育所需用品 (三)细胞培育液 (四)细胞的原代、继代培育 (五)细胞的冻存和苏醒 (六)细胞净化 44 (一)细胞培育所需前提 1 养分需求 2 细胞的保存情况 温度: 37 ℃ O 2 CO 2 : 5% CO 2 +H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO3 - pH: 7.2-7.4 浸透压 湿度 3 无净化 4 无毒 45 (二)细胞培育所需用品: 无菌间、超净事情台,压力蒸汽消毒器,电热枯燥箱,滤器,酸缸,紫外灯 CO 2 培育箱 倒臵显微镜 液氮罐 主动两重纯水蒸馏器,纯水仪 耗材:培育瓶,吸管,电动吸收器,培育板, 冻存管 46 1 1. . 超净事情台(Hood): A. 程度流超净事情台(Horizontal air flow) B. 垂直流超净事情台(Lateral air flow) C. 层流氛围超净事情台(Laminar air flow) 47 程度流超净事情台 背送风,但病毒是不适用的,简单对人有害 48 垂直流超净事情台 49 50 超净事情台的干净保护: 连结事情台上 无死角 ,让氛围获得充实过滤,即实验终了后,将一切的 用品珍藏起来,事情台上 只留有 酒精灯及 橡皮头。事情前和事情终了都要用 酒精擦桌面 ,假如桌面滴有培育液等物,尝试完毕后应先用水擦,然后用酒精再擦。还需按期检测事情台滤器过滤的服从。 51 全部接种操纵应在近火焰处停止,且行动要疾速 正 正 确 错 误 52 接种过程当中尽能够到达悬空请求 避免操纵带来的净化 正 正 确 错 误 53 接种时不得用手打仗瓶盖内壁或瓶口 正 正 确 错 误 54 瓶盖朝上放,接种终了后立刻盖好瓶口 正 正 确 错 误 55 2 ,CO2 培育箱 CO2 培育箱设定的前提为37 ℃ ℃, ,100% 湿度,5 %CO 2 。  利用CO2 培育箱培育细胞时应留意的成绩 ① 用 用 螺旋口瓶 培育细胞时,需将瓶盖 微松 ,以包管通气。 ② ② 连结培育箱内 氛围洁净。 。 按期消毒( (90 ℃ ℃, ,14 h) 。 ③ ③ 箱内 灭菌蒸馏水3000 毫升蒸馏水, 以连结箱内湿度,制止培育液蒸发。 56 湿度以第二天第一次开门,能看到玻璃门上的水珠 57 3 3 . 消毒装备: A A. . 高压消毒锅 ( Autoclave ) : 110 C , 15 lb , 20 分钟 ,合适于橡皮 、 纸 、 布 、 塑料成品和液体( (9 9 lb , 10 分钟 ) 等 。消毒后必需在烤箱中高温烤干 。 B B. . 干热消毒箱: 150- - 200 C , 2 2 - -3 3 小时。 。 合适于玻璃器皿 、 金属东西等。 。 C C. . 酒精消毒 : 剖解东西 、 塑料器皿 、 植物外相 等 , 酒精浓度为 75 - 95% % 。AG电投厅登陆 58 高压消毒锅 59 D. 滤膜过滤: 正压过滤: : 爬动泵通入培液;通入气体 。 负压过滤:用水泵或油泵抽滤。 滤膜孔径为 0.22 m m ,为耽误滤膜寿命可同时增加 0.45 m m 和 1.2 m 滤膜。 60 滤 膜 滤 器 61 两种:1,一次性滤器;2,买滤膜本人装(需求消毒) 62 4 4. . 蒸馏器与去离子纯水体系: 1 1 ) 用三蒸水 , 经由过程去离子纯水 体系 , 电阻需到达 170 万欧姆 以上 。 2 2 ) 特地的去离子水体系 5 5. . 倒臵相差显微镜: 需用 相差镜头 和 滤光片 , 集光器的挑选应与接物镜的放大倍数...

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