各人好，在上篇文章《Helicos、SeqLL、瀚海基因、真迈生物》中，我们“寻根溯源”，向各人扼要报告Helicos的汗青和它的手艺担当者SeqLL、真迈的故事。明天的下篇，我们要向各人引见基于而又差别于Helicos tSMS手艺的真迈生物单份子测序手艺。

　　“真迈生物利用的测序手艺相较Helicos到底做了哪些改良”不断是我们测序圈都比力体贴、存眷的成绩，以是明天的文章内容次要是环绕二者比照（真迈手艺 比照 Helicos手艺）睁开的，我们根据测序湿尝试流程分为2大部门：

　　文库构建的简朴快速是Helicos不断夸大的次要手艺劣势之一，我们以一般gDNA文库构建为例，建库流程大抵分为3个次要步调:

　　1.1 基因组片断化（酶切大概物理打断）。关于一些严峻降解的FFPE、古DNA样本大概具有特定长度的cfDNA样本则无需再片断化，待测片断长度范畴能够从几十到几千bp，现在朝的NGS文库则请求经由过程片断挑选来得到必然长度范畴的插入片断，这是由于tSMS手艺的文库构建和碱基旌旗灯号收罗单位的天生其实不需求借助PCR，以是无需思索差别长度的待测片断的扩增偏好性成绩。

　　下图展现今朝支流测序手艺的碱基旌旗灯号收罗单位的天生方法，我们在图中能够看到桥式PCR（比方片断太长会搭到邻近纳米孔中）、待测片断环化与滚环扩增都对片断range请求比力严厉。

　　1.2/1.3待测片断3增加polyA。双链待测片断高温变性为单链，利用结尾转移酶在3端具有-OH的单链待测片断上增加必然长度的PolyA尾巴以便后续与Flowcell外表上polyT（50nt）杂交分离完成待测片断的牢固。

　　polyA的长度掌握在50～200nt（长度需Flowcell外表poly dT(50nt)），单链待测片断的polyA与Flowcell外表的polyT分离以下图所示，为避免待测片断3端在后续聚合反响过程当中持续延长滋扰一般的荧光旌旗灯号收罗，需求在polyA结尾增加Block（利用结尾转移酶增加1个ddATP作为阻断碱基，ddATP上还能够标识表记标帜一个Cy3荧光基团用于后续的碱基旌旗灯号辨认的Template generation）

　　完成以上三个次要步调即获得了3端 polyA-block的单链待测片断（文库构建终了），文库完成定量后即开端样品加载事情，Helicos的样本加载需求约5.5个小时，分为2个次要步调

　　Sample Loading行将构建完成的单链文库样本经由过程公用的样本加载仪器加载到Flowcell长进行PolyA/T杂交，而Fill and Lock则是在杂交完成后（以下图所示），参加dTTP（补平）和假造可逆停止子（Virtual Terminator）dATP、dCTP、dGTP（锁定），使得每条胜利杂交在Flowcell上的待测片断的测序肇端位点“跨过”3端polyA这些“无用序列”而且在polyA上游的第1个非A碱基聚合对应的假造停止子（A、C、G）锁定测序链。

　　如上图所示，颠末Fill和Lock后的测序链（图中蓝色链）的3端都有1个假造停止子临时“封堵”，并且假造停止子均标识表记标帜了Cy-5荧光基团，可用于后续的Template Genaration。

　　我们仍是以一般gDNA文库构建流程为例，真迈生物的建库流程也是分为3步，局部流程只需求1.5小时便可完成（与Helicos流程比拟工夫收缩近1半）。AG电投厅

　　待测片断毗连双链讨论（见下图），比拟Helicos利用结尾转移酶在3端增加长度不定的polyA（需求70min），AT毗连室温下只需15min便可完成。

　　毗连产品纯化，需求留意的是由于毗连产品其实不需求PCR，以是即便单端讨论毗连产品（下图红框）也为有用毗连，这相较于不异样本肇端量的NGS建库流程，大猛进步了文库的转化率（80%），低落样本消耗，进步了文库多样性。

　　其建库流程的“简约快速”，我们参考真迈生物gDNA建库仿单的产物概述能够更加直观的感遭到。

　　以上内容即为文库构建与样本加载的引见，我们能够看到简朴快速的样本处置不断是Helicos的劣势之一，真迈生物的优化改良让这个劣势愈加较着。

　　3端polyA的Block上标识表记标帜Cy3荧光基团（绿），在开端聚合测序之前利用532nm波长激光激起（以下右图）

　　Block并未标识表记标帜Cy3荧光基团，而是操纵LOCK环节的可逆停止子（标识表记标帜Cy5荧光基团，红），在开端聚合测序前用647nm波长激光激起（以下左图）

　　线种dNTP/Cycle)，增长到(2种dNTP/Cycle)，以下图所示，两种荧光基团别离标识表记标帜两种可逆停止子（比方dGTP、dTTP），利用红绿混淆激光同时对发作聚合反响的G、T停止激起并收罗荧光旌旗灯号，完成旌旗灯号收罗后，去掉Block，参加A、G。

　　今朝(2种dNTP/Cycle)计划能够将聚合比进步一倍以上（0.5），以是针关于NIPT、CNV-Seq、PGS等短读长使用，真迈生物的GenoCare1600测序体系到达均匀读长35bp所需的测序轮回数在70-80个Cycle（单色荧光计划能够需求140Cycle+）大大收缩了测序工夫。

　　按照真迈生物公然的质料显现，今朝基于GenoCare1600的NIPT和PGS项目（SE35）的TAT（Turn Around Time）均24小时，固然我们将TAT拆分后发明GenoCare1600的测序工夫仍较长（约为NextSeq500的2倍+，16小时），但其充实整合建库工夫劣势后（1.5小时）在项目TAT上曾经与支流临床测序平台在统一个程度。

　　综合上述状况，真迈生物的Genocare1600测序体系取长补短，聚焦在短读长（在特定的读长范畴内，文库构建的快速把“测序速率的不敷抹平”）、数据阐发基于Read count程度（全流程无需PCR，定量阐发更精确）的临床诊断使用得以阐扬出其最大功力（比方NIPT、PGS、CNV-Seq、mNGS），但我们看到，该手艺在测序精确率和测序工夫上具有很大的有提拔空间。

　　明天关于真迈生物单份子测序手艺的引见就到这里，由于文章篇幅限定，我们没法对部门主题内容睁开议论，且受限于今朝公然信息较少，文中内容不免有疏漏的地方，仅供各人参考，后续我们能够按照读者反应状况另作新章。

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